A CRISPR génszerkesztő technológia az elmúlt évtizedek egyik legnagyobb biológiai áttörése, amely gyakorlatilag minden modern biológiai kutatás és orvosi fejlesztés szerves részévé vált. Azonban van egy különleges hely a sejten belül, amelyhez ez a technológia eddig nem tudott könnyen hozzáférni: a mitokondriumok.
A mitokondriumok és a CRISPR kihívása
A mitokondriumok olyan bab alakú sejtszervecskék, amelyek elsődleges feladata az energia előállítása, de számos más létfontosságú funkciót is ellátnak. Ezekben a szervecskékben található egy saját, körkörös DNS (mtDNS), amely azonban elzárt helyen van, így a CRISPR-Cas9 rendszerek nem tudják azt közvetlenül elérni vagy módosítani.
Michal Minczuk, a Cambridge-i Egyetem genetikus kutatója szerint „a mitokondriumok kimaradtak abból a CRISPR-Cas9 forradalomból, amely 12 évvel ezelőtt robbant be”. Ez azért jelent problémát, mert több mint 300 mtDNS mutáció okoz súlyos, jelenleg gyógyíthatatlan mitokondriális betegségeket, amelyek látás- és hallásvesztést, izomproblémákat vagy akár rohamokat is kiválthatnak. Ezek a betegségek körülbelül 1 az 5000 emberből érintenek valakit.
A mitokondriális DNS eredete és sajátosságai
A mitokondriumok eredete körülbelül 1,5 milliárd évvel ezelőttre nyúlik vissza, amikor egy ősi egysejtű mikroorganizmus, az úgynevezett archaeon bekebelezett egy baktériumot, amely túlélte ezt az eseményt és szimbiózisba lépett gazdasejtjével. Ez az esemény indította el az eukarióták – növények, állatok és gombák – evolúcióját.
A bekebelezett baktérium megtartotta körkörös DNS-ét, amely azonban az idők során nagyrészt átkerült a sejtmagba. Az állatok evolúciós vonalán ez a genetikai anyag mindössze 37 gépre csökkent, amelyek 13 fehérjét kódolnak az energia előállításához szükséges folyamatokban.
Az mtDNS jelentős különbségei:
- Anyai öröklődés: Az mtDNS általában kizárólag anyai ágon öröklődik.
- Többszörös másolat: Egyetlen mitokondriumban több mtDNS példány is lehet.
- Saját fehérjeszintetizáló gépezet: A mitokondrium képes saját RNS-t és fehérjéket előállítani.
- Nagyobb mutációs ráta: Az mtDNS mutációs aránya 10-20-szor magasabb, mint a nukleáris DNS-é.
- Korlátozott javító mechanizmus: A mitokondrium csak bizonyos hibákat képes kijavítani; gyakran egyszerűen kidobja a sérült DNS-t.
A génszerkesztés nehézségei a mitokondriumokban
A legnagyobb akadályt az jelenti, hogy az mtDNS egy kettős membránnal körülvett térben található, amely megakadályozza az idegen nukleinsavak bejutását. Bár felmerült, hogy CRISPR-alapú eszközök esetleg képesek lehetnek áthatolni ezen akadályokon, sok kutató még mindig szkeptikus.
Alternatív megoldások: ZFNs és TALENs
Mielőtt a CRISPR népszerűvé vált volna, már léteztek olyan génszerkesztő eszközök, amelyek képesek voltak behatolni a mitokondrium membránján. Ezek közé tartoznak a cink-ujj nukleázok (ZFNs) és a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALENs), amelyek célzottan képesek kettős szálú mtDNS-t hasítani.
Ezek az enzimek nem javítják meg közvetlenül a hibás DNS-t – mint ahogy azt a nukleáris DNS esetében teszi a sejt –, hanem eltávolítják azt. Ezután az ép mtDNS másolatai szaporodnak el, így csökkentve a mutáns példányokat egy elfogadható szintre. Ezt az állapotot nevezzük heteroplazmiának: amikor egészséges és hibás mtDNS együtt létezik egy sejtben.
Carlos Moraes, a Miami Egyetem genetikus kutatója szerint „a normál példányok szaporodása kompenzálja majd az eltávolított hibásakat”. Ennek ellenére ez az eljárás még nem jutott el klinikai alkalmazásig, ráadásul nem hatékony olyan betegségek esetén, ahol minden mtDNS példány mutáns – például Leber-féle örökletes optikai neuropátia (LHON).
Az igény egy új generációs génszerkesztő eszközre
A kutatók olyan módszereket keresnek, amelyek nem csak hasítanak vagy eltávolítanak DNS-szakaszokat, hanem képesek precíz bázisszerkesztésre anélkül, hogy RNA irányítóra lenne szükség – hiszen ez utóbbi nehezen jut át a mitokondriális membránokon.
Bázisszerkesztés CRISPR nélkül: áttörés az mtDNS módosításában
2016-ban David Liu és munkatársai bevezették a bázisszerkesztést – egy olyan technikát, amely lehetővé teszi egyetlen DNS-bázis (például C → T vagy A → G) pontos átalakítását anélkül, hogy kettős szálú törést okoznának. Ez forradalmasította a nukleáris DNS szerkesztést.
Azonban ez a módszer nem működött az mtDNS-en, mivel CRISPR-hoz kötött irányító RNS nem jut át könnyen a mitokondrium membránján. „Nem értünk el nagy sikert” – mondja Liu.
DddA toxinnal történő bázisszerkesztés: új remény
2018-ban Joseph Mougous mikrobiológus felfedezte egy Burkholderia cenocepacia baktérium által termelt toxint (DddA), amely képes C-bázisokat T-vé alakítani baktériumgenomokon belül. Mougous felvette a kapcsolatot Liuval, aki felismerte ennek potenciálját az mtDNS szerkesztésében.
A DddA enzim azonban önmagában túl mérgező lenne – ezért Liu és csapata kettévágta két inaktív részre úgy, hogy csak akkor aktiválódjon, ha ezek megfelelő módon összeállnak. Az irányítást pedig nem RNA-val oldották meg, hanem TALEN-proteinekkel célozták meg pontosan az mtDNS szakaszokat.
Kitekintés: A jövő útja
Ezek az új technológiák már most lehetővé teszik pontosabb állatmodellek létrehozását mitokondriális betegségekről. Ha sikerül biztonságossá és hatékonnyá tenniük ezt az mtDNS szerkesztést emberi sejtekben is, akkor valódi orvosi áttörést érhetünk el: akár gyógyíthatóvá válhatnak azok a genetikai rendellenességek is, amelyek ma még kezelhetetlenek.
Összegzésként: bár a CRISPR forradalmasította a génszerkesztést számos területen, addig az mtDNS szerkesztése komoly kihívást jelentett. Az új bázisszerkesztési technikák – különösen azok RNA-mentes változatai – ígéretes megoldást kínálnak arra, hogy végre hatékonyan kezeljük ezeket az örökletes betegségeket.