Bevezetés
A LiPyDau egy innovatív liposzómás gyógyszerformuláció, amely hidrogénezett szójabab foszfatidilkolin (HSPC), koleszterin és polietilén-glikol (PEG) módosított foszfatidiletanolamin komponensekből áll. Ez a cikk részletesen bemutatja a LiPyDau előállításának, jellemzésének, valamint in vitro és in vivo vizsgálatainak módszereit és eredményeit.
Anyagok és reagensek
A LiPyDau előállításához ultrapure vizet (Milli-Q, Millipore, Franciaország) használtak. A lipid komponensek közé tartozik a szintetikus, nagy tisztaságú hidrogénezett szójabab foszfatidilkolin (HSPC), 3β-hidroxi-5-koleszten (koleszterin), valamint a 1,2-disztearoyl-sn-glycero-3-foszfoetanolamin-N-[amino(polietilén-glikol)-2000] (DSPE-PEG 2000) és annak biotinilált változata (DSPE-PEG-2000). Ezeket az Avanti Polar Lipids (USA) vagy a Merck Life Science Kft. (Németország) biztosította.
Egyéb vegyszerek közé tartozik a kloroform (LiChrosolv®, Sigma-Aldrich), sósav és nátrium-hidroxid oldatok (1 M), L-hisztidin, D-(+) szacharóz, ammónium-szulfát, valamint különféle pufferoldatok, melyeket 0,22 μm-es szűrőkön filtráltak át a tisztaság biztosítása érdekében.
LiPyDau liposzóma formuláció előállítása
A LiPyDau liposzóma készítése lipidfilm hidratációs és extrudálási módszerrel történt:
- A lipidkeveréket (HSPC, koleszterin, DSPE-PEG2000) kloroformban oldották fel, majd nitrogénáramban vékony filmréteggé szárították.
- Az így kapott lipidfilmet vákuumban egy éjszakán át inkubálták a maradék oldószer eltávolítására.
- Ezután 0,25 M ammónium-szulfát oldattal hidratálták pH 6,5 mellett, hogy összesen 16 mg/mL lipidkoncentrációt érjenek el.
- A keveréket mágneses keverővel 60 °C-on 30 percig keverték.
- A multilamelláris vezikulumokat (MLV) öt ciklusban fagyasztották folyékony nitrogénben majd olvasztották fel 60 °C-on.
- Ezután 13-szor extrudálták 100 nm-es polikarbonát membránon keresztül LIPEX® Extruder segítségével.
- A liposzóma közegét L-hisztidin/szacharóz pufferré cserélték PD-10 oszloppal.
- Végül PyDau-hidrokloridot adtak hozzá (2 mg/mL oldatból), majd 60 °C-on egy órán át keverték.
- A nem encapsulált PyDau eltávolítására kétszeri PD-10 desalting oszloppal történő tisztítást alkalmaztak.
LiPyDau jellemzése
Morfológia vizsgálata
A liposzómák morfológiáját fagyasztott töréses transzmissziós elektronmikroszkópiával (FF-TEM) elemezték. A mintákat glicerin hozzáadásával fagyasztották le Freonban, majd −100 °C-on törték meg. A törési felületekről platina-karbon bevonat készült, melyeket megtisztítottak és TEM rácsokra helyeztek. A vizsgálatokat MORGAGNI 268D mikroszkóppal végezték.
Méretelemzés MRPS-sel
A liposzóma koncentrációját és méreteloszlását mikrofluidikus ellenállás impulzus érzékeléssel (MRPS) határozták meg nCS1 műszerrel. A mintákat BSA oldattal hígították és centrifugális szűrőn átszűrték. A mérési tartomány 65–400 nm között volt.
Tömegspektrometria és HPLC analízis
Tömegspektrometriás méréseket Sciex 6500QTrap műszerrel végeztek HPLC elválasztással Agilent 1100 rendszerben. A célmolekula kvantifikálása pozitív ion MRM módban történt Kinetex EVO C18 oszlopon víz/formiánsav és acetonitril/formiánsav mobil fázisokkal lineáris gradiens elúcióval. Az inkubációs idő 10 perc volt, az injektált mennyiség 5 µL.
Encapsulációs hatékonyság és drog/lipid arány
Az encapsulációs hatékonyságot (EE%) az alábbi képlettel számolták:
EE% = (W_entrapped drug / W_initial drug) × 100
A drog/lipid arány (D/L) pedig moláris arányként:
D/L = mol drug / mol lipid
Stabilitás vizsgálatok
A LiPyDau hosszú távú stabilitását dinamikus fényeloszlás (DLS) és spektrofotometriai módszerekkel követték egy évig 4 °C-on tárolva. A gyógyszerretenciót centrifugális desalting oszlopokkal mérték, majd az encapsulált drog felszabadítását abszolút etanolban végzett savas kezelés után spektrofotometriával detektálták 485 nm-en.
Sejtvonalak és tenyésztési körülmények
A vizsgálatok során összesen 34 különböző sejtvonalat használtak az NCI-60 panelből különböző daganattípusokból: melanoma, colorectalis carcinoma, tüdőrák, prosztatarák, leukémia, petefészekrák, gasztrointesztinális daganatok, veserák és emlőrák sejtvonalakat. Ezek RPMI vagy DMEM táptalajon tenyésztek megfelelő kiegészítőkkel (10% magzatborjú szérum). DT40 sejtvonalakat speciális feltételekkel tartottak fenn.
In vitro citotoxicitási vizsgálatok
A sejtek automata folyadékadagolóval kerültek beültetésre 384 lyukú lemezekbe 2500 sejt/lyuk sűrűséggel. Adherens sejtek esetén 24 órás tenyésztést követően adagolták a vegyületeket; nem adherens sejtek esetén két órával a beültetés után. A vegyszereket sorozatos hígításban adagolták további 20 µL térfogatban. A sejtek további 72 órás inkubáció után PrestoBlue életképességi reagenssel lettek értékelve. Az IC50 értékeket sigmoidal görbeillesztéssel határozták meg GraphPad Prism programmal.
Állatkísérletek
Állatgondozás és etikai engedélyek
Minden állatkísérletet a Nemzeti Onkológiai Intézet Állatkísérleti Bizottsága hagyott jóvá Magyarországon. Az állatokat steril környezetben tartották szabályozott hőmérsékleten (22–24 °C), páratartalommal (40–50%), napi fényciklussal (12/12 óra). Az állatok szabad vízfogyasztással és sterilizált standard takarmánnyal voltak ellátva.
Toxicitási vizsgálatok in vivo
A PyDau és LiPyDau maximális tolerálható dózisát FVB egereken határozták meg egyszeri intravénás beadással különböző dózisokban. Az állatok állapotát napi szinten monitorozták fájdalom vagy diszkomfort jelei után. Az MTD-t azon legmagasabb dózisnak tekintették, ahol minden egér túlélte a kezelést 30 napig.
Xenograft tumor modellek
- Uterin szarkóma modell: MES-SA és multidrog-rezisztens MES-SA/Dx5 sejtvonalakat NOD/SCID egerekbe injektáltak subcutan módon; kezelés akkor kezdődött, amikor a tumorok elérték a 200 mm³ térfogatot.
- Humán betegből származó tumor xenograft: Egy invazív tüdő adenokarcinómából származó tumordarabokat NSG egerekbe ültettek be; több hónapos propagálást követően különböző kemoterápiás kezeléseket teszteltek LiPyDau-val összevetve.
- Egyéb allograft modellek: Egér melanoma (B16-F1), tüdőkarcinóma (LLC) és emlőrák (4T1-LUC) sejtvonalakat használtak alograft tumorok létrehozására különböző egérfajtákban; utóbbi modellben biolumineszcens képalkotást alkalmaztak a tumor növekedésének nyomon követésére.
- Genetikailag módosított egérmodell: BRCA1-/-; p53-/- FVB egerekből származó emlőtumor darabokat vagy organoidokat transzplantáltak ortotopikusan vad típusú FVB/NHanHsd egerekbe; kezelések között doxorubicin maximális tolerálható dózisát alkalmazták ismételten.
Képalkotás és képelemzés
A hematoxilin-eozin festett metszeteket Pannoramic 1000 csúszaszkannerrel digitalizálták nagy felbontásban. Az automatikus képfeldolgozás során Ilastik pixel-osztályozót használtak három kategóriára: életképes szövet, nekrózis és háttér. Eredményként nekrózis arányt ((eta_I)) számoltak ki az adott kép pixeleinek arányában:
(eta_I = frac{N_I}{N_I + V_I})
ahol (N_I) a nekrózisnak megfelelő pixelek száma, (V_I) pedig az életképes szövet pixeleinek száma volt. Ez az érték jól tükrözi a kezelés hatékonyságát.
Helikáz aktivitás gátlása és DNS kötési vizsgálatok
Helikáz gátlási assay
A BLM helikáz által katalizált DNS szálelválasztást fluorometriás módszerrel mérték egy fluoreszcens jelölésű oligonukleotid alapú rendszerben. Dau és PyDau vegyületeket preinkubáltak DNS-sel különböző koncentrációban majd ATP-tartalmú reakciókeverékkel indították el a helikáz aktivitást. A fluoreszcencia növekedése jelezte a DNS szálak elválását; az adatok elsőrendű kinetikai modell szerint illeszkedtek kiválóan.
Kötési vizsgálatok gélelektroforézissel
- Kis méretű dsDNS: Fluoreszcens jelölésű 34 bp hosszú DNS-t incubáltak Dau-val vagy PyDau-val majd denaturáló poliakrilamid gélen futtatták TBE-Urea körülmények között; a kötődést változás jelezte a migrációs mintázatban.
- Nagy méretű plazmid DNS: Egy EcoRI-re vágott ~2880 bp hosszú DNS-t incubáltak Dau-val, DOX-szal vagy PyDau-val majd fenol-kloroform tisztítás után lúgos agarózgél elektroforézisben elemezték a konformációs változásokat.
Molekuláris dokkolás számítások
Kovalens dokkolást végeztek Schrödinger CovDock moduljával egy formaldehid keresztkötött daunorubicin-PDB szerkezet alapján. Három dokkolási pozíciót generáltak alapos pózelőrejelzés mellett. Ezek stabilitását metadinamika alapú pozíciószimulációkkal tesztelték Desmond programmal. Az ábrákat Maestro szoftverrel készítették el.
Következtetések
A LiPyDau liposzóma formuláció sikeresen előállítható lipidfilm hidratációs-extrudálási technikával magas encapsulációs hatékonysággal. Jól definiált méreteloszlással rendelkezik, stabil egy évig hűtve tárolva. In vitro citotoxicitási vizsgálatok széles sejtvonal spektrumon mutattak ígéretes eredményeket. In vivo xenograft modellekben pedig kedvező toxicitási profillal rendelkezik és tumorcsökkentő hatást mutatott különböző daganattípusok esetén. Molekuláris dokkolások megerősítették hatásmechanizmusának alapját helikáz gátlással kombinálva DNS kötési affinitással.
Ez az átfogó kutatás jelentős lépést jelenthet új liposzómás kemoterápiás készítmények fejlesztésében.
Forrás: https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-025-02444-1