A Staphylococcus aureus baktériumok és az őket érintő vírusok (bakteriofágok) vizsgálata kulcsfontosságú a mikrobiológia és molekuláris biológia területén. Ebben a cikkben részletesen bemutatjuk a kísérletekhez használt bakteriális törzseket, tenyésztési körülményeket, fágpropagációs technikákat, molekuláris klónozási eljárásokat, valamint az ezekhez kapcsolódó biokémiai és mikroszkópos módszereket.
Bakteriális törzsek és tenyésztési körülmények
A kutatás során alkalmazott S. aureus törzsek listája megtalálható a kiegészítő adatok között. Az S. aureus RN4220 törzset 37 °C-on, 220 fordulat/perc sebességű rázás mellett tenyésztették Brain Heart Infusion (BHI) táptalajon. A tenyészeteket kloramfenikol (10 mg/ml) vagy eritromicin (10 mg/ml) hozzáadásával tartották fenn, hogy fenntartsák a pC194 vagy pE194 alapú plazmidokat.
A kromoszómába integrált Sau–Thoeris vagy Sau–thsB1/B2 géneket tartalmazó törzseknél az eritromicin koncentrációját 5 mg/ml-re csökkentették a szelekcióhoz. A génexpresszió indukálására szükség esetén 1 mM IPTG-t adtak hozzá.
Bakteriofág propagáció
A fágokat magas titerszámú készítmény előállításához használták. Ehhez egy éjszakai S. aureus RN4220 tenyészetet 1:100 arányban hígítottak BHI táptalajban, amely 5 mM CaCl2-ot tartalmazott, majd középső log fázisig (~90 perc) növesztették.
A tenyészetet OD600=0,5 értékre állították be (~1×108 CFU/ml), majd fertőzték fágokkal MOI=0,1 (~1×107 PFU/ml) arányban vagy egyetlen plakk kiválasztásával/fagyasztott készletből történő kaparással. A fertőzött kultúrát 37 °C-on rázva inkubálták és a lízis megjelenését (~3-4 óra alatt teljes turbidity-vesztés) figyelték.
A lízis után a kultúrát centrifugálták (4 300 g, 10 perc), majd a szupernatánst steril membránszűrőn (0,45 μm) átszűrték és 4 °C-on tárolták. A fágkoncentrációt tízszeres hígításos sorozattal határozták meg BHI lágy agar lemezeken, RN4220 baktériumokkal és 5 mM CaCl2-val kiegészítve. Az inkubáció után megszámolták az egyedi plakkokat (baktériummentes zónákat), így kalkulálták a vírus titert.
Molekuláris klónozás és kromoszómába integráció
A plazmidokat és oligonukleotid primereket a kiegészítő adatok tartalmazzák. A Sau–Thoeris rendszer génjeit G-blokk szintézisből, genomikus DNS-ből vagy fágkészletekből nyerték ki.
A Sau–thsA/B1/B2 vagy Sau–thsB1/B2 géneket eritromicin-rezisztencia kazettával együtt integrálták az hsdR génbe (S. aureus RN4220-ban), amely egy defektív R-alegységet kódol a restrikció-modifikációs rendszerben. Ez az integrációs hely korábban bizonyítottan nem befolyásolja a baktérium növekedését.
A PCR termékeket elektroporációval juttatták be elektroporábilis S. aureus RN4220 sejtekbe, melyek pPM300 rekombináz plazmidot hordoznak. Az integránsokat kolónia PCR-rel és funkcionális immunitás tesztekkel szűrték, majd Sanger szekvenálással igazolták.
Profág rekombináció és szelekció
A profág törzseknél kloramfenikol-rezisztencia kazettát integráltak loxP helyekkel körülvéve a célzott fág génekbe homológ régiók segítségével. Az elektroporációt követően kloramfenikol szelektálással választották ki az integránsokat, melyeket kolónia PCR-rel és immunitási tesztekkel ellenőriztek, majd Sanger szekvenálással igazoltak.
Lágy agar fágfertőzés és folyadékkultúrás fertőzés
- Lágy agar fertőzés: Éjszakai baktériumtenyészetet BHI lágy agarhoz kevertek 5 mM CaCl2-val, majd lemezekre öntötték. Fág hígításokat cseppentettek az agar felületére, száradás után 37 °C-on inkubálták éjszakára. Másnap megszámolták az egyedi plakkokat.
- Folyadékkultúrás fertőzés: Éjszakai tenyészeteket hígítottak BHI + CaCl2-val és antibiotikummal, középső log fázisig növesztettek (OD600=0,5). A kívánt MOI-nek megfelelő mennyiségű fágot adtak hozzá, majd 96 lyukú lemezekbe osztották szét. Az OD600-at mikroplate olvasóval mérték 10 percenként 37 °C-on rázva.
Mhp mutáns fág előállítása és izolálása
A vad típusú Φ80α-vir fágot olyan S. aureus RN4220-on passzírozták át, amely pCR186 plazmidot hordozott mhpW84K génnel homológ régiókkal körülvéve. Egyedi plakkokat izoláltak úgy, hogy a lysate-t CRISPR-Cas rendszert hordozó RN4220-ra cseppentették lágy agarban vad típusú fág elleni szelekció céljából.
A mutációt Sanger szekvenálással igazolták.
Fehérjeexpresszió és tisztítás
A ThsA, ThsB1 és ThsB2 fehérjéket IPTG indukcióval expresszálták S. aureus RN4220-ban BHI táptalajon OD600=1 eléréséig. A sejtek lízise lizosztafin, DNáz I és proteáz inhibitor koktél jelenlétében történt sonikációval.
A tisztítást kobalt-affinitás kromatográfiával végezték: kötés után magas sótartalmú pufferrel mosták, majd imidazollal eluálták a fehérjéket. Az eluátumot dializálták reakciópufferbe (Trisz pH 7.4, NaCl, glicerin, β-merkaptoetanol), majd koncentrálták centrifugális szűrők segítségével.
A tiszta fehérjéket SDS-PAGE-vel ellenőrizték további in vitro vizsgálatokhoz.
Nukleotid-szintézis és NADase aktivitás vizsgálatok
Nukleotid-szintézis reakciókat végeztek NAD+, fejfehérje és enzim jelenlétében Trisz alapú pufferben 37 °C-on két órán át. A termékeket centrifugális szűrőkön átszűrték fehérje eltávolítására majd HPLC-vel elemezték.
NADase aktivitást ThsA enzimmel vizsgáltak hasonló körülmények között NAD+ jelenlétében; a reakciótermékeket ugyancsak HPLC-vel elemezték.
NAD+ kimutatása sejtlízátumból színreakciós módszerrel
S. aureus RN4220 részleges vagy teljes Thoeris rendszerrel rendelkező tenyészeteket fertőztek fágokkal MOI=1 arányban vagy mitomicin C indukcióval profág aktiválás céljából. A sejtlízátumokat lizostafinnal kezelték majd NAD+/NADH kimutatást végeztek Abcam színreakciós készlettel gyártói protokoll szerint.
Nukleotid HPLC analízis részletei
A reakciótermékeket Agilent 1460 HPLC rendszerrel elemezték C18-os oszlopon 260 nm hullámhosszon detektálva. A mobil fázist KH2PO4/K2HPO4 puffer alkotta acetonitril gradienssel kombinálva alkalmazták.
Szerkezeti előrejelzés és elemzés AlphaFold segítségével
A Thoeris fehérjék és különböző Mhps aminosav-szekvenciáit bioinformatikai adatbázisokban keresték meg konzervált domének után kutatva. Az AlphaFold 3 programmal hexamer szerkezeteket jósoltak meg; bár az ipTM/pTM értékek mérsékeltek voltak (0.2–0.6), szerkezeti illesztések alapján RMSD értékek alacsonyak (<1 Å monomerre).
A szerkezeteket PyMol segítségével hasonlították össze ismert Φ80α prohead szerkezettel (PDB:6B0X). A ConSurf adatbázissal konzervált funkcionális régiókat jelöltek ki.
Molekuláris tömeg meghatározása SEC-Mass Photometry kombinációval
Tiszta fehérje mintákat Superdex 200 Increase oszloppal választottak el méret szerint Trisz alapú pufferrendszerben (NaCl, glicerin, DTT). Mass photometriás méréshez mintákat hígítottak kb. 100–200 nM koncentrációra új áramlási kamrába juttatva őket.
Minden mintát legalább háromszor mérték meg újra reprodukálhatóság érdekében; fókuszt automatikusan tartotta az eszköz total internal reflection technológiával.
Időfüggő fluoreszcens mikroszkópia mikrofluidikai rendszerrel
S. aureus sejtek Thoeris rendszerekkel mikrofluidikai kamrába kerültek CellASIC ONIX2 rendszerrel; BHI + CaCl2-os táptalajt folyamatosan áramoltattak rajtuk keresztül.
Egy órás adaptáció után GFP-jelölt Φ80α-vir fagokat vezettek át rajtuk egy órán keresztül; ezt követően visszatértek táptalajra. Képalkotást Nikon Ti2e mikroszkóppal végezték 1000x nagyítással kétperces időközönként fluoreszcens GFP filterrel (expozíciós idő:100 ms).
Eskapád fagok generálása és izolálása Thoeris szelekció mellett
S. aureus RN4220-at Φ80α-vir faggal fertőztek MOI=1 arányban rövid ideig (20 perc), majd lízisig inkubáltak három órán át. A kapott fagokat sterilizálták és magas titerszámú mutáns könyvtárat hoztak létre lágy agar fertőzés segítségével Thoeris rendszerekkel rendelkező gazdasejteken öt egymást követő passzírozással.
Kiválasztott plakkokat DNS izolálás után teljes genom szekvenálásra küldték tovább az eredmények megerősítésére.
Cobalt-affinitásos ThsB komplex dúsítás és detektálás
His6-címkézett ThsB1 vagy ThsB2 fehérjéket expresszáltak komplementer Flag-címkézett társaikkal IPTG indukció mellett; ezt követően sejteket fagfertőzésnek vagy profág indukciónak vetettek alá mitomicin C-vel.
Lízist követően ultracentrifugálással tisztított lysate-t kobalt-affinitásos gyantára vitték fel; kötött komplexeket többször mosták magas sótartalmú pufferral majd imidazollal eluálták.
A kapott frakciókat SDS-PAGE-gel és western blot-tal ellenőrizték anti-His6 illetve anti-Flag antitestekkel horseradish peroxidáz konjugátummal detektálva.
Pfilogenetikai elemzés a S. aureus-ból származó Thoeris rendszerekről
Doron et al tanulmányában bioinformatikailag előre jelzett Thoeris rendszereket elemeztek Geneious Prime szoftverrel egyedi rendszerek azonosítása céljából protein szekvenciák alapján.
Statisztikai elemzés és reprodukálhatóság biztosítása
- Minden statisztikai elemzés GraphPad Prism 9.5.1 verzióval készült;
- Kísérletek három biológiai ismétléssel rendelkeznek;
- Csoportok közötti összehasonlításokhoz kétoldali t-próbát alkalmaztak korrekció nélkül;
- Mikroszkópos képek legalább két független kísérletből származnak;
- Minta méreteket nem határoztak meg előre statisztikai módszerekkel, de megfelelnek a bakteriális genetika területén elfogadott szabványoknak;
- Kísérletek reprodukálhatósága biztosított mind in vivo fagfertőzéses teszteknél mind in vitro biokémiai vizsgálatoknál;
- Eredmények megbízhatósága támogatja az olyan fenotípusok megfigyelését mint fagrezisztencia vagy NAD(H) koncentráció változásai.
Záró gondolatok – kutatási tervezés átláthatósága
További információk a kutatás tervezésével kapcsolatban elérhetők a Nature Portfolio Reporting Summary dokumentumban, amely részletesen bemutatja az alkalmazott módszereket és protokollokat annak érdekében, hogy az eredmények megbízhatóak legyenek és más kutatók számára reprodukálhatók maradjanak.