Ha valaha is kíváncsi voltál arra, hogyan lehet laboratóriumi körülmények között feltérképezni egy rovarirtó szer hatását a szúnyogok fehérjéire, akkor ez a cikk neked szól. Az Anopheles gambiae, a malária terjesztője, különösen érdekes célpont a kutatók számára, hiszen a rovarirtókkal szembeni rezisztencia komoly problémát jelent a járványok elleni küzdelemben. Ebben az írásban részletesen bemutatom, hogyan zajlik az in vitro jelölés és gélalapú analízis, amellyel a pirimifosz-metil és annak aktív metabolitja, a pirimifosz-metil oxon hatásmechanizmusát vizsgálják.
Szúnyog homogenátum előkészítése és próba kezelés
Képzeld el, hogy húsz darab 3–5 napos nőstény Anopheles gambiae (Kisumu törzs) szúnyogot veszünk alapul. Ezeket 500 mikroliter 1× DPBS pufferben homogenizáljuk, majd 21130×g erősséggel centrifugáljuk 5 percig 4 °C-on. A kapott szupernatáns fehérjetartalmát Bradford assay-vel mérjük meg, majd 1 mg/ml-re normalizáljuk. Ezután 48 mikroliter homogenátumot veszünk, amelyhez különböző kezeléseket adunk:
- pirimifosz-metil inhibitor (10 vagy 100 µM végső koncentráció),
- pirimifosz-metil oxon (szintén 10 vagy 100 µM),
- desthiobiotin-fluorofoszfonát (FP) próba (2 vagy 10 µM),
- vagy DMSO kontroll.
Ezeket egy órán át inkubáljuk 30 °C-on, folyamatos rázás mellett. Ezután minden mintához hozzáadunk egy fix mennyiségű T-FP próbát (2 µM végső koncentrációban), kivéve a negatív kontrollt, amely DMSO-t kap. A hővel denaturált homogenátumok szolgálnak negatív kontrollként annak igazolására, hogy a jelölés valóban aktivitásfüggő. Az inkubáció további egy órán át tart, majd SDS-PAGE mintákhoz való pufferrel keverjük és röviden melegítjük.
Gél-elektroforézis és képalkotás
A mintákat NuPAGE Bis-Tris Mini Geleken futtatjuk (4–12% gradiens), MOPS SDS futtató puffert használva. Az elektroforézis 200 V-on zajlik 50 percig. A géleket tetrametilrhodamin (TRITC) szűrővel rendelkező iBright FL1500 rendszerrel képezzük le, majd savas metanolban áztatjuk egy órán át a festék eltávolítására. Ezután kolloid festékkel újra festjük és vízzel öblítjük őket, majd ismét lefényképezzük.
Proteomikai elemzés pirimifosz-metil oxon célpontokra FP-ABPP módszerrel
A pirimifosz-metil oxon aktív metabolitját használva vizsgáltuk az Anopheles gambiae fehérjeinterakcióit. A homogenátumokat előkezeltük pirimifosz-metil oxonnal (100 µM végső koncentráció), majd hozzáadtuk az ActivX™ Desthiobiotin-FP Serin-hidroláz próbát (2 µM). A próba koncentrációját gondosan optimalizáltuk, hogy telített kötődést érjünk el – ez kritikus lépés volt a megbízható célpontdetektáláshoz.
Minden kezelést háromszor végeztünk el a reprodukálhatóság érdekében. A mintákat -80 °C-on tároltuk további elemzésre.
Túlzott reagensek eltávolítása és fehérje precipitáció
A fagyasztott mintákat jégen olvasztottuk fel, majd centrifugáltuk a fehérjék kicsapódására. A pelletet háromszor mostuk hideg metanollal ultrahangos kezelés mellett, hogy eltávolítsuk a nem kötődő anyagokat. Ezután SDS oldatban oldottuk fel újra a fehérjéket, többszöri sonikációval és melegítéssel biztosítva a teljes oldódást.
Streptavidin-alapú FP-jelölt fehérje gazdagítás
A mintákhoz előmosott streptavidin gyöngyöket adtunk, amelyek megkötötték az FP-próbával jelölt fehérjéket. Többszörös mosási lépések követték különböző oldatokkal (SDS, urea), hogy kizárólag specifikus kötődéseket tartsunk meg.
On-bead redukció, alkilezés és emésztés
A gyöngyökön lévő fehérjéket dithiothreitol segítségével redukáltuk, majd iodoacetamiddal alkileztük. Ezután trypszin emésztést végeztünk éjszakán át, hogy peptidekre bontsuk őket – ez alapvető lépés volt az LC-MS/MS analízishez.
Tryptikus peptidek eluálása és tömegspektrometria
A peptideket savasítottuk formiánsavval és előkészítettük folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) vizsgálatra Dundee-ben található FingerPrints Proteomics Facility-ben. A peptidek tisztítása C18-os fázison történt, majd egy Ultimate 3000 RSLCnano rendszerrel választották szét őket egy Orbitrap Exploris 480 tömegspektrométerhez csatlakoztatva.
A mérések során precíz beállításokkal dolgoztak: MS1 felvételek nagy felbontással készültek (60 000), ezt követték MS2 fragmentációs mérések az intenzívebb ionokra fókuszálva. Ez lehetővé tette a fehérjék pontos azonosítását és kvantifikálását.
Adatfeldolgozás és bioinformatikai elemzés
A nyers LC-MS/MS adatokat MaxQuant szoftverrel dolgozták fel az Anopheles gambiae referencia proteomja alapján. Számos módosítást figyelembe vettek (pl. cisztein karbamidmetilezés fixként; metionin oxidáció stb.). A hamis pozitív arányt szigorúan 1%-ra állították be mind protein-, mind peptid-szinten.
A kvantitatív összehasonlításokat MaxLFQ algoritmussal végezték el, amely lehetővé teszi két biológiai minta közötti precíz összevetést peptidek intenzitása alapján. Az eredményeket LFQ-Analyst platformmal vizualizálták és statisztikailag elemezték: log₂-transzformálták az adatokat, hiányzó értékeket imputáltak MNAR módszerrel.
A jelentős eltéréseket p-érték ≤0,05 mellett abszolút log₂ fold change ≥1 kritériummal határozták meg. Ezen túl hierarchikus klaszterezést is alkalmaztak az adatok csoportosítására.
Szubcelluláris frakcionálás: mitokondrium izolálása szúnyog torokból
Körülbelül 80 darab nőstény szúnyog torzsát használtak (~40 mg), amelyeket jeges pufferben homogenizáltak Dounce homogenizátorral. Két centrifugálási lépéssel elkülönítették a sejtmagokat és törmeléket az mitokondriumoktól és citoplazmától.
Ezt követően további centrifugálással ülepítették ki a mitokondriumokat. Minden frakcióból mintát tartottak vissza Western blot elemzéshez három markerfehérje kimutatására: Coeae6g enzimre, alfa-tubulinra (citoplazmatikus marker) és ATP5A-ra (mitokondriális marker).
Baculovírus-alapú rekombináns Coeae6g expresszió Sf9 sejtekben
A Anopheles coluzzii Coeae6g génjét klónozták pFastBac/CT-TOPO vektorba baculovírus expresszióhoz. A bacmid DNS-t E.coli DH10Bac sejtjeiben állították elő, majd Sanger szekvenálással ellenőrizték a helyes klónozást.
Sf9 rovarsejteket fertőztek meg rekombináns baculovírussal 72 órára magas MOI-val (5). Kontrollként YFP-expresszáló vírus is készült. Az expresszált enzimeket Western blot segítségével igazolták.
Biokémiai vizsgálatok és gátlási kinetika Coeae6g esetén Sf9 sejtekben
A rekombináns Coeae6g aktivitását α-naphthyl acetáttal (α-NA), β-naphthyl acetáttal (β-NA) és p-nitrophenyl acetáttal (p-NPA) mérték spektrofotométerrel. Az α-NA esetében például a reakciót követően Fast Blue festékkel komplexet képeztek, amit 570 nm-en mértek.
Kinetikai paramétereket (Km és Vmax) határoztak meg nemlineáris regresszióval GraphPad Prism szoftverrel különböző substrát koncentrációkon.
Továbbá nyolc különböző rovarirtó szerrel tesztelték az enzim gátlását: pirimifosz-metil és oxonja mellett malathion/malaoxon, bendiocarb, propoxur, permethrin és deltamethrin szerepeltek a listán. Az IC50 értékeket is kiszámolták – vagyis azt a koncentrációt ahol az enzim aktivitása felére csökken.
Szúnyogtenyésztési körülmények
Minden Anopheles gambiae törzs standard laboratóriumi körülmények között nevelkedett: 26±2 °C hőmérsékleten, ~70% páratartalommal napi 12 órás világosság-sötétség ciklussal. Lárvák haleleséget kaptak; felnőtteknek pedig cukorszirupot biztosítottak.
UAS-Coeae6g transzgénikus vonalak létrehozása ΦC31-mediált kasettacsere segítségével
A Coeae6g kódoló régiókat PCR-rel amplifikálták két laboratóriumi törzs cDNS-éből (Anopheles gambiae Kisumu, Anopheles coluzzii Ngousso). Ezeket YFP-jelölt UAS-plazmidba klónozták be.
Mikroinjektálták őket olyan embriókba amelyek már tartalmazták az attP helyeket integrációhoz egy integráz helper plazmiddal együtt. Az F0 generáció fluoreszcens jelei alapján választották ki sikeres integránsokat; ezekből fenntartottak stabil vonalakat homo- illetve heterozigóta állapotban.
Driver × Responder keresztezések Coeae6g expresszió előidézésére
A transzgénikus UAS-Coeae6g vonalakat keresztezve egy Ubi-GAL4 driver vonallal (Anopheles gambiae polyubiquitin promoterral) indukálták a Coeae6g expresszióját különböző kísérleti állatokban. A kettős pozitív utódokat fluoreszcens mikroszkóppal válogatták ki.
Insekticid rezisztencia profil meghatározása GAL4/UAS utódokon WHO bioassay segítségével
A rezisztenciát WHO szabvány szerint végzett csöves bioassay-jel mérték fel: legalább három ismétlésben 20–25 nőstény szúnyogon tesztelték őket különböző rovarirtók diszkrimináló dózisaival.
A halálozás kevesebb mint 90%-a rezisztenciára utalt; míg 98–100% halálozás érzékenységet jelentett. Emellett LD50 értékeket is meghatároztak különböző pirimifosz-metil koncentrációkon Polo Plus szoftverrel elemezve.
Záró gondolatok – miért izgalmas ez?
Szerintem lenyűgöző látni azt a részletességet és precizitást, amivel ma már képesek vagyunk feltérképezni egyetlen rovarirtó szer molekuláris célpontjait egy egész élőlényből! Ez nem csak alapkutatás – közvetlenül hozzájárulhat ahhoz is, hogy jobban megértsük a rezisztencia kialakulását és új stratégiákat dolgozzunk ki ellene.
Ha belegondolsz: minden egyes lépés – legyen szó homogenizálásról vagy masspektrometriáról – aprólékosan optimalizált protokollokon alapul.
Ez pedig kulcsfontosságú ahhoz is, hogy új generációs rovarirtók fejlesztésekor ne csak találgatásokra hagyatkozzunk.
Te mit gondolsz? Vajon milyen irányba fejlődhet még ez a terület?
