Bevezetés: Az Urolithin A (UA) egy természetes vegyület, amely az utóbbi években nagy érdeklődést váltott ki az immunrendszer és a mitokondriális funkciók támogatásában. A jelen cikkben egy átfogó, randomizált, kettős vak, placebo-kontrollált klinikai vizsgálat részleteit mutatjuk be, amely egészséges felnőtteken vizsgálta az UA hatásait.
1. A vizsgálat tervezése és időbeosztása
A MitoImmune néven futó kutatás egy randomizált, kettős vak, placebo-kontrollált intervenciós tanulmány volt, amely egészséges résztvevőket vont be. A résztvevők két csoportra oszlottak: az egyik csoport napi egyszeri 1000 mg UA-t (Mitopure, Amazentis SA) kapott orálisan (n=25), míg a másik csoport placebót (n=25), amely lecitinből, közepes láncú trigliceridekből és glicerin-monostearátból állt Mitopure nélkül.
A napi 1000 mg-os adagolás összhangban áll korábbi klinikai vizsgálatokkal, amelyek az izomfunkciókat értékelték. A résztvevők három alkalommal jártak a klinikán: a kiindulási állapotban (baseline), 7 nap után (d7), valamint a 28. napon (d28). Minden látogatás alkalmával vérmintát vettek és dokumentálták az esetleges mellékhatásokat.
A vizsgálatot a Frankfurti Egyetem helyi etikai bizottsága hagyta jóvá (Ethikkommission des Fachbereichs Medizin der Goethe-Universität; engedélyszám: 2022-745_2). A toborzás 2023 márciusában kezdődött és 2023 decemberében zárult le.
2. Résztvevők kiválasztása – beválasztási és kizárási kritériumok
A vizsgálatba olyan egészséges felnőtteket vontak be, akik életkora 45 és 70 év között volt, testtömegindexük (BMI) pedig 20.0 és 34.99 kg/m² közé esett. Minden résztvevő írásos beleegyező nyilatkozatot adott.
Kizárták azokat, akik krónikus betegségekben szenvedtek vagy olyan gyógyszereket szedtek, amelyek befolyásolhatják az immunrendszert vagy a mitokondriális működést. Továbbá nem engedélyezték a kortikoszteroidok, antibiotikumok, anabolikus szteroidok, kreatin vagy immunerősítő kiegészítők használatát a vizsgálat előtt legalább 45 nappal.
A dohányzás és túlzott alkoholfogyasztás szintén kizáró ok volt. A résztvevők vállalták, hogy nem változtatnak étrendjükön vagy fizikai aktivitásukon a vizsgálat ideje alatt.
3. Vizsgálati termékek és randomizáció
Az UA vagy placebo kapszulákat Patheon Softgels B.V. készítette elő. Egy palack 30 lágy kapszulát tartalmazott; minden kapszula 250 mg UA-t vagy placebót tartalmazott. A napi adag négy kapszulából állt.
A termékeket egy nem beavatkozó személy kódolta el a gyártónál; a randomizációt pedig kettős vak módon végezték el az eCRF rendszer segítségével korcsoport, nem és BMI alapján blokkrandomizációval (blokkméret: 4).
4. Betartás és mellékhatások jelentése
A betartást a visszahozott fel nem használt kapszulák számának megszámlálásával mérték. Amennyiben ez nem volt lehetséges, a résztvevőktől önbevallás alapján kértek adatot.
Bármilyen mellékhatást a résztvevőknek haladéktalanul jelezniük kellett a vezető kutató orvosnak. Az eseményeket a Common Terminology Criteria for Adverse Events verzió 5.0 szerint kategorizálták; életveszélyes esemény nem fordult elő.
5. Adatkezelés és laboratóriumi elemzések
Minden adatot jó klinikai gyakorlat szerint kezeltek; az adatok bevitele validált adatkezelő rendszerben történt (Secutrial). Vérminták biokémiai és hematológiai elemzését klinikailag validált rendszerekkel végezték Frankfurtban.
6. UA biohasznosulásának mérése
A plazma UA és konjugált formájának (UA-glukuronid) koncentrációját mérték a kiindulási ponton és a 28 napos kezelés után. Az értékek alatti mérési határértéket nullának vették.
7. PBMC izolációja és kezelése
35 ml perifériás vért gyűjtöttek EDTA-tartalmú csövekbe, majd centrifugálással elválasztották a plazmát és sejtes elemeket. A PBMC-ket FicollPaque Plus vagy LymphoPrep segítségével izolálták, majd fagyasztó közegben tárolták -80 °C-on hosszú távra.
8. Áramlási citometria és immunfenotípus elemzés
A spektrális áramlási citometriát három batch-ben végezték el PBMC mintákon mindkét csoportból (UA és placebo). Felületi marker paneleket alkalmaztak különböző sejttípusok azonosítására (CD3+, CD4+, CD8+, NK sejtek stb.). Az adatok FlowJo szoftverrel kerültek feldolgozásra.
9. Mitokondriális funkciók vizsgálata
- MitoTracker festés: MitoTracker Green jelölte a mitokondriális tömeget; MitoTracker Red CMXRos mérte a mitokondriális membránpotenciált.
- SCENITH módszer: Metabolikus függőséget mértek különböző metabolikus gátlószerekkel (pl. 2-deoxy-glükóz, oligomycin), puromicin beépülésével mérve a fehérjeszintézis aktivitását.
- PINK1 és Parkin expresszió: Ezeket mitofágiával kapcsolatos fehérjéket áramlási citometriával detektálták.
- mtDNS/nuDNS arány: PCR alapú kvantifikációval mérték a mitokondriális DNS arányát nukleáris DNS-hez képest.
10. T-sejt stimulációs tesztek
T-sejteket anti-CD3/CD28 stimuláló gyöngyökkel aktiváltak 4 napig, majd citokin expressziót mérték intracelluláris festéssel IL-4 és TNF tekintetében.
11. Plazma citokin szintek mérése
A pro- és anti-inflammatorikus citokinek (IL-6, TNF, IL1-β, IL-10) koncentrációját LEGENDplex multiplex immunoassay segítségével határozták meg technikai duplikátumokban.
12. Fagocitózis kapacitás vizsgálata
A monocyta fagocitózis képességét pHrodo E.coli Red BioParticles segítségével mérték áramlási citometriával; CD3−CD14+ sejtekre fókuszálva.
13. Egység-RNS szekvenálás (scRNA-seq)
Kiválasztott mintákból egység-szintű RNS szekvenálást végeztek Singleron technológiával baseline és 28 nap után mindkét csoportból (5-5 fő). Az adatok normalizálása, klaszterezése Seurat csomaggal történt R környezetben; batch korrekció Harmony algoritmussal valósult meg.
14. Differenciális génexpresszió elemzés és útvonalvizsgálatok
- Differenciálisan expresszált gének meghatározása Seurat FindMarkers funkcióval;
- Gén ontológiai elemzés clusterProfiler-rel;
- Ingenuity Pathway Analysis segítségével aktivált/inaktivált útvonalak feltérképezése;
- Upstream regulator analízis az expressziós változások magyarázatára.
15. Ex vivo mitokondriális paraméterek elemzése humán immunsejteken
PBMC-ket UA-val vagy kontroll DMSO-val kezelték különböző időpontokon; mitokondriális paramétereket TMRM, LysoTracker red DND-99 és MitoTracker Green festésekkel mérték áramlási citometriával.
16. Statisztika és reprodukálhatóság
Minden adat egyedi mintából származik; ismételt mérés nem történt ugyanazon mintán belül az elsődleges végpont esetében. Elemzéshez ismételt méréses vegyes modelleket alkalmaztak SAS szoftverrel figyelembe véve korcsoportot, nemet, BMI-t és alapértékeket is.
17. Etikai nyilatkozat és szerzői hozzájárulások
A kutatás megfelelt minden vonatkozó etikai előírásnak; minden szerző hozzájárult munkájához az adott szerepkör szerint. A tanulmány nem járt stigmatizációval vagy személyes kockázattal a résztvevők számára.